Il progetto finanziato dal Bando AIRett 2018 ai gruppi di ricerca coordinati dai dr. M. Vacca L. Casalino (Istituto di Genetica e Biofisica-CNR di Napoli), S. Russo (Istituto Auxologico di Milano) e T. Pizzorusso (Università di Firenze) mira a identificare composti che inducano l’espressione biallelica di MeCP2 e che, nel contesto patologico della RTT, siano in grado di determinare un recupero funzionale delle cellule malate.
La riattivazione della copia genica di MeCP2 localizzata sul cromosoma X “silente” rappresenta una possibile strategia terapeutica per la Rett. Il raggiungimento di tale obiettivo è però ostacolato dalla limitata conoscenza in generale dei meccanismi molecolari dell’inattivazione del cromosoma X e nello specifico dei fattori coinvolti nella regolazione del gene MeCP2.
Al fine di identificare gli induttori della riattivazione di MeCP2 e, possibilmente, i meccanismi
molecolari che sottendano la regolazione epigenetica della sua espressione, abbiamo sviluppato una strategia sperimentale basata sull’impiego di modelli preclinici di colture neurali in vitro. Tali cellule, derivate dal differenziamento in vitro di cellule staminali pluripotenti, sono state ottenute sia da modelli murini manipolati geneticamente al locus MeCP2, sia da cellule umane staminali pluripotenti indotte (hiPSC) derivate direttamente da pazienti con RTT. Nello specifico, col supporto della Mouse Modeling Facility dell’IGB-CNR di Napoli abbiamo generato topi che recano una marcatura genetica dei due alleli di MeCP2 con reporter autofluorescenti di due differenti colori (XMeCP2:eGFP/XMeCP2:mCherry), per una visualizzazione diretta della proteina MeCP2 fisiologicamente prodotta dal cromosoma X attivo e di quella prodotta attraverso la riattivazione dell’allele silente.
Dalle femmine transgeniche con doppio reporter verranno derivati diversi sistemi cellulari per la generazione di progenie neurale in vitro, sulla quale eseguire screening molecolari di composti ad azione epigenetica. Attualmente, è in corso la derivazione e la caratterizzazione di cellule staminali embrionali (mESCs) e a breve procederemo con l’isolamento di cellule staminali neurali.
Indipendentemente dal tipo staminale utilizzato, nelle cellule neurali generate in vitro, la riattivazione del transgene portato dall’X inattivo verrà rilevata attraverso la comparsa del segnale di autofluorescenza latente. I saggi cellulari di riattivazione saranno eseguiti in automazione, attraverso l’impiego
di una stazione robotica integrata, il CellMaker, situata presso il laboratorio di automazione all’IGB-ABT. Questa piattaforma, operando in sterilità, è capace di gestire colture cellulari e librerie di composti in formato micropiastra e quindi di eseguire screening molecolari su saggi cellulari basati sulla misurazione quantitativa di segnali di fluorescenza in cellule intatte. Le molecole-studio saranno aggiunte sia singolarmente sia combinandole fra di loro, per sfruttare ogni eventuale potenziale sinergico e favorire così le possibilità di successo a costi contenuti.
In una fase di post-convalida, i composti capaci di riattivare selettivamente l’allele silente di MeCP2 in neuroni murini verranno ri-testati utilizzando un modello umano di malattia, le iPSCs di pazienti RTT con specifiche mutazioni, per derivare in vitro cellule neurali umane.
