La sindrome di rett (rtt) è una patologia progressiva dello sviluppo neurologico e rappresenta una delle più comuni cause di disabilità mentale nelle bambine. sulla base delle caratteristiche cliniche vengono identificate una forma classica di malattia, dovuta a mutazioni nel gene MECP2, ed alcune varianti, dovute in parte a mutazioni in MECP2 (variante di zappella) e in parte a mutazioni nei geni CDKL5 (variante con convulsioni ad esordio precoce) e FOXG1 (variante congenita). il gene MECP2 codifica per una proteina con funzione un regolatore trascrizionale, come FOXG1. CdKl5 è invece una proteina chinasi. Gli intensi sforzi di ricerca degli ultimi anni hanno permesso di dimostrare che meCP2 svolge molteplici ruoli all’interno della cellula e hanno iniziato a chiarire le funzioni degli altri due geni. tuttavia i meccanismi della malattia restano in gran parte sconosciuti. Per stabilire un modello cellulare umano che ci aiutasse a chiarire i meccanismi molecolari della rett abbiamo utilizzato un nuovo procedimento, detto riprogrammazione genetica, che permette di derivare cellule staminali pluripotenti, le iPsCs (induced Pluripotent stem Cells), direttamente da cellule della pelle dei pazienti. le iPsCs hanno potenzialità paragonabili alle cellule staminali embrionali e come queste possono essere cresciute in vitro per lungo tempo e essere indotte a differenziare in diversi tipi di cellule mature, tra cui i neuroni. rappresentano quindi il modello ideale per studiare i meccanismi della malattia direttamente sulle cellule nervose. abbiamo quindi deciso di riprogrammare fibroblasti di pazienti con mutazioni in MECP2, CDKL5 e FOXG1. abbiamo ad oggi iPsCs derivate da cellule di una paziente con mutazione p.r306C in MECP2 e di 2 pazienti (un maschio e una femmina) con mutazioni in CDKL5 (rispettivamente p.T288i e p.q347X). stiamo completando la caratterizzazione delle cellule derivate da una paziente con mutazione in FOXG1 (p.W255X). l’analisi delle cellule ottenute dalla paziente femmina ha dimostrato che le iPsCs mantengono lo stato di inattivazione del cromosoma X caratteristico della cellula da cui sono derivate; è stato quindi possibile isolare dalla stessa paziente con mutazione in CDKL5 iPsCs che esprimono la copia mutata del gene e altre che esprimono quella normale, che rappresentano il controllo ideale per gli esperimenti.

sulle cellule iPs così ottenute abbiamo deciso di analizzare il profilo di espressione genica. Poiché per la paziente femmina con mutazione in CDKL5 era disponibile un clone di controllo derivato dalla stessa paziente ma esprimente la copia normale del gene, abbiamo deciso di effettuare l’analisi per prime sulle cellule dei pazienti con mutazione in CDKL5. da questa analisi sono stati identificati un gruppo di geni con espressione alterata, uno dei quali, Grid1, ci è sembrato particolarmente promettente in quanto svolge un ruolo importante nei neuroni. una prima verifica di questi risultati ha confermato la riduzione dell’espressione di Grid1 nelle iPsCs con mutazione in CDKL5; il gene risulta inoltre sottoespresso nel clone di iPsCs con mutazione in MECP2, suggerendo un possibile legame funzionale tra le due proteine. è attualmente in corso la verifica di questi dati.

è inoltre attualmente in corso la caratterizzazione dei neuroni ottenuti dalle cellule con mutazione in MECP2 e CDKL5. una prima analisi è stata indirizzata a verificare se tali neuroni presentassero la riduzione delle dimensioni del corpo cellulare e del nucleo. le nostre analisi preliminari hanno evidenziato una riduzione di circa il 14% delle dimensioni del nucleo per le cellule con mutazione in MECP2, in accordo con i dati riportati da diversi studi sia in tessuti autoptici di pazienti che in modelli animali e cellulari (figura). non si osserva invece alcuna variazione delle dimensioni del nucleo nelle cellule derivate dai pazienti con mutazioni in CDKL5, suggerendo che questo fenotipo sia specifico
dell’assenza di meCP2. sono attualmente in corso analisi più approfondite per verificare se si osservino alterazioni dello sviluppo e del funzionamento dei neuroni.

Analisi delle dimensioni del nucleo in neuroni derivati da iPSCs delle pazienti.
i nuclei sono stati evidenziati tramite colorazione con daPi (blu). i nuclei dei neuroni (indicati dalle frecce gialle in a) sono stati distinti da quelli delle cellule non neuronali tramite colorazione con β-iii-tubulina, una molecola tipica dei neuroni (in rosso in B). C) il confronto con le dimensioni del nucleo di cellule di un individuo sano (control) ha evidenziato una riduzione del 14% circa delle dimensioni dei nuclei dei neuroni mutati in MECP2 (iPsC#r306C) e una dimensione equivalente al normale nelle cellule con mutazione in CDKL5 (iPSC#58).