RW Invernizzi, G. Sacchetti, M. Carli – Laboratorio di Neurochimica e Comportamento, Dipartimento di Neuroscienze dell’Istituto di Ricerche Farmacologiche “Mario Negri”, Milano

Il progetto si proponeva di caratterizzare le alterazioni comportamentali prodotte dalla mutazione (troncazione 308) del gene Mecp2 espressa in forma omozigote in topi femmina (Mecp2^308-\-), un modello sperimentale di Sindrome di Rett. Questo obiettivo, da considerarsi di tipo generale, era necessario per ampliare le nostre conoscenze sulla mutazione e propedeutico all’identificazione dei bersagli molecolari del gene Mecp2 implicati nella genesi e, potenzialmente, nella terapia della sindrome di Rett.

La scelta del modello si è basata sulla considerazione che la mutazione Mecp2^308-\- è rappresentativa delle mutazioni che producono una troncazione della proteina frequentemente riscontrate nelle pazienti Rett, ma soprattutto permetteva di studiare l’evoluzione delle alterazioni comportamentali nel tempo in quanto la sopravvivenza di questi topi è di gran lunga superiore a quella osservata in topi “knockout” per Mecp2, spesso usati negli studi precedenti. La scelta di usare topi femmina potrebbe sembrare ovvia dato che la stragrande maggioranza dei pazienti Rett è di genere femminile. Tuttavia, nella maggior parte degli studi sperimentali precedenti sono stati usati topi maschi per evitare la variabilità fenotipica associata al fenomeno dell’inattivazione random del cromosoma X. In considerazione di questo problema e nonostante le pazienti Rett esprimano la mutazione in forma eterozigote, si è scelto di studiare il fenotipo dei topi femmine portatrici della mutazione in forma omozigote.

I topi Mecp2^308-\- e i controlli “wild type” (WT) sono stati confrontati in diversi test comportamentali normalmente utilizzati per studiare la funzione motoria, l’emotività, l’apprendimento e la memoria, e l’interazione sociale. Per valutare l’evoluzione nel tempo dell’effetto della mutazione, i test sono stati condotti su topi di 2-4 mesi e ripetuti sugli stessi soggetti a 8-10 mesi di età.

RISULTATI

All’età di 6 mesi circa, la sopravvivenza dei topi Mecp2^308-/- era del 100% e fino a questa età, l’aspetto esteriore (cura del manto, vivacità, socialità) non era diverso da quello dei topi WT. Fino all’età di circa sei mesi l’incremento ponderale dei topi Mecp2^308-/- era simile a quello osservato nei topi WT. Dopodiché, si osservava una ridotta crescita ponderale probabilmente causata dalle aumentate difficoltà motorie che sono già presenti in topi Mecp2^308-/- di 8-12 settimane i quali mostrano un ridotto indice globale delle funzioni senso-motorie (Neuroscore), tremori delle zampe anteriori e ridotta capacità di aggrappamento (Wire test). I deficit peggioravano nel tempo fino all’ultima osservazione fatta a circa 10 mesi di età quando si osservava un tremore più marcato delle zampe anteriori, il fenomeno del “clasping” cioè l’adduzione delle zampe posteriori quando gli animali erano sospesi per la coda e una spiccata cifosi. La coordinazione motoria dei topi Mecp2^308-/- valutata nei test del “rota-rod” e “beam-walking” appariva normale a 2-4 mesi, ma era decisamente peggiore rispetto ai WT a 10 mesi. I topi Mecp2^308-/- mostravano una maggiore attività esploratoria nel test di “open-field” e un fenotipo meno ansioso nel “elevated plus maze”.

La registrazione dell’attività locomotoria e le sue variazioni cicliche misurate nell’arco delle 24 h per un periodo di 7 giorni metteva in evidenza una posticipazione del picco dell’attività notturna di circa 2 h nei topi Mecp2^308-/- di 4 mesi, senza cambiamenti significativi dell’attività massima. L’attività diurna dei topi Mecp2^308-/- era simile a quella dei WT. Nei topi Mecp2^308-/- più anziani si osservava una riduzione dell’attività motoria notturna.

Funzioni cognitive

I topi Mecp2^308-/- non mostravano deficit in tre test largamente utilizzati per valutare le funzioni cognitive quali il Morris’ water-maze (memoria e apprendimento spaziale), la passive avoidance (apprendimento) e il novel object recognition test (memoria episodica). La ripetizione dei test a 8-10 mesi, confermava l’assenza di deficit cognitivi.

Interazione sociale

L’interazione sociale dei topi Mecp2^308-/- con i conspecifici non era diversa da quella osservata nei topi WT sia nei giovani che in quelli più anziani.

In sintesi, i risultati dei nostri studi sui topi Mecp2^308-/- mettono in evidenza chiare alterazioni nella performance e nell’apprendimento motorio, mentre le funzioni cognitive limitatamente ai domini considerati nei test di memoria e apprendimento e l’interazione sociale non erano alterate. Tuttavia, deficit cognitivi sono stati osservati in altri studi in topi maschi emizigoti per il gene Mecp2³⁰⁸ di circa 20 settimane o più anziani, ma soltanto in alcuni test. È possibile che differenze di genere e ceppo dei topi usati in diversi laboratori oltre ad aspetti metodologici, contribuiscano a tali differenze. Tutto ciò indica che la mutazione Mecp2³⁰⁸ causa deficit motori più robusti e più facilmente evidenziabili dei disturbi cognitivi.

Dopo aver completato la valutazione comportamentale e cognitiva, sono state avviate alcune indagini di tipo biochimico mirate a esplorare la presenza di alterazioni dei meccanismi glutammatergici cerebrali. Nei topi Mecp2^308-/- è osservata una riduzione dei livelli di glutammina nel corpo striato e nell’ippocampo, due regioni cerebrali coinvolte rispettivamente nei processi motori e cognitivi. La glutammina è fondamentale per la sintesi del glutammato nei neuroni e quindi per la neurotrasmissione, ma anche per il metabolismo della microglia e degli astrociti e nel metabolismo energetico. È stata osservata inoltre una riduzione dei livelli di taurina ippocampale e un aumento del metabolismo della serotonina nel ponte cerebrale. Queste alterazioni potrebbero contribuire alle disfunzioni dello sviluppo dei neuroni e delle sinapsi (taurina) e del controllo dei ritmi respiratori (serotonina) riscontrate nelle pazienti.

Ulteriori studi sono necessari per chiarire la relazione tra le alterazioni della biochimica cerebrale e il fenotipo motorio e cognitivo causato dalle mutazioni di Mecp2.