Negli ultimi anni il team di ricerca della Genetica Medica di Siena diretto dalla Prof.ssa Alessandra Renieri si è focalizzato sullo studio della terapia genica in diverse malattie, fra cui la Sindrome di Rett. In particolare, gli studi sulla Sindrome di Rett sono coordinati dalla Prof. ssa Ilaria Meloni, che da anni studia i meccanismi alla base della sindrome e ha una vasta esperienza nell’ambito della ricerca applicata a questa patologia. Recentemente sono stati pubblicati due lavori che testimoniano i grandi passi in avanti fatti dal gruppo nell’ambito della patologia. In particolare, è stata dimostrata l’efficienza di applicazione della terapia genica tramite CRISPR/Cas9 per la correzione di una variante ricorrente (hotspot), la c.473 C>T (p.(T158M)), localizzata sul gene MECP2 (Croci et al., 2020). La stessa tecnica è stata utilizzata per la correzione di due mutazioni localizzate sul gene FOXG1 (Croci et al., 2020). Alla base di questi studi ci sono le cellule staminali pluripotenti indotte (induced Pluripotent Stem Cells, iPSCs). Attraverso la biopsia cutanea, un metodo minimamente invasivo che consiste in un prelievo di cute di pochi millimetri, è possibile recuperare i fibroblasti del paziente, cellule tipiche del tessuto connettivo. Successivamente i fibroblasti possono essere riprogrammati in iPSCs. Da questo modello cellulare, grazie ad un processo di differenziamento, si ottengono neuroni con la mutazione del paziente. I neuroni derivati da iPSCs rappresentano un modello cellulare fondamentale perstudiaregliaspettimolecolari della malattia e testare nuovi approcci terapeutici.
Grazie agli importanti risultati ottenuti, nel 2020 il gruppo ha partecipato con successo al bando dello European Joint Programme for Rare Diseases (EJP-RD) dal titolo “Ricerca pre-clinica per lo sviluppo di terapie efficaci per le malattie rare”. Il progetto, che si intitola “Personalized MECP2 gene therapy using CRISPR/Cas9 technology coupled to AAV-mediated delivery in 3D cell culture and KI mice” (acronimo MECPer-3D), sta partendo in questi giorni e avrà una durata di 3 anni. Responsabile della conduzione dello studio (Principal Investigator PI e coordinatore) è la Prof. ssa Ilaria Meloni. Del team di Siena fanno inoltre parte la Prof.ssa Elisa Frullanti, ricercatore e Project manager, e la Dott.ssa Susanna Croci, postdoc presso il laboratorio, che si occuperà del disegno sperimentale. Pilastri fondamentali del progetto sono la rete di collaborazione tra ricercatori italiani ed europei, che portano al progetto ognuno uno specifico bagaglio di conoscenze e esperienze, e la collaborazione con AIRett, il cui aiuto sarà prezioso per il coinvolgimento delle pazienti e la diffusione della conoscenza del progetto e dei suoi risultati. In aggiunta al gruppo del coordinatore, il team comprende un secondo gruppo italiano, quello del Prof. Mario Chiariello, Group Leader presso il Core Research Laboratory (CRL) dell’Istituto per lo Studio, la Prevenzione e la Rete Oncologica (ISPRO) che collaborerà nel valutare l’efficacia di correzione del nostro sistema analizzando alcuni specifici meccanismi biologici che risultano alterati nella Sindrome di Rett. Partecipano inoltre 3 ricercatori europei: la Dott.ssa Julia Ladewig, Group Leader presso l’Institute of Reconstructive Neurobiology (University of Bonn), che, insieme al Dott. Andrea Carlo Rossetti, si occuperà di sviluppare organoidi cerebrali o colture cellulari 3D partendo dalle iPSCs generate dalle cellule delle pazienti; il Prof. Miguel Chillon, ICREA Research Professor presso Vall d’Hebron Institut de Recerca (VHIR) e Universitat Autònoma de Barcelona (UAB) e il Dott. Angel Edo, che si occuperanno della creazione e produzione di virus con tropismo specifico per il sistema nervoso centrale, cioè in grado di bersagliare specificamente/principalmente il sistema nervoso centrale; il Dott. Yann Hérault, direttore di ricerca presso il French National Centre for Scientific Research (CNRS), group leader presso il Department of translational medicine and neurogenetics, “Institut de Génétique, Biologie Moléculaire et Cellulaire” e direttore del Mouse Clinical Institute-PHENOMIN National Infrastructure. Il Dott. Hérault, del cui team fanno parte la Dott.ssa Tania Sorg, il Dott. Hugues Jacobs, il Dott. Fabrice Riet e il Dott. Mohammed Selloum, si occuperà di testare la terapia genica nel topo, il modello animale scelto per gli studi in vivo.

Il progetto si propone di validare tramite studi in modelli sperimentali (studi pre-clinici) l’applicazione della terapia genica per la correzione di 4 varianti hotspot nel gene MECP2: c.473 C>T (p.(T158M)), c.502C>T (p(R168X)), c.763C>T (p.(R255X)) e c.916C>T (p.(R306C)). Il metodo di correzione che verrà utilizzato per il ripristino della sequenza corretta è il gene editing, una tecnica che permette di modificare la sequenza del gene senza alterarne l’espressione. Tale approccio è stato preferito al gene replacement, che nella maggior parte dei casi prevede l’aggiunta di una copia addizionale del gene per sopperire alla funzione di quello mutato; questo processo risulta rischioso in quanto potrebbe causare un’espressione anomala di MECP2, con risultati imprevedibili. Il gene editing sarà basato su 2 passaggi che, combinati insieme, permettono il ripristino della sequenza corretta: il primo è il taglio del doppio filamento di DNA tramite il CRISPR/Cas9, una sorta di sistema immunitario utilizzato dai batteri per difendersi dai virus e che oggi è sfruttato dai ricercatori di tutto il mondo per la manipolazione del genoma delle cellule eucariotiche. Il secondo processo è l’Homology-Directed Repair-HDR, un meccanismo di riparazione che le cellule utilizzano normalmente per riparare il DNA in seguito alla rottura del doppio filamento.

Il progetto sarà articolato in diverse fasi interconnesse tra loro. In primo luogo, dopo l’arruolamento delle pazienti, i fibroblasti recuperati tramite biopsia cutanea verranno utilizzati per generare le iPSCs che saranno la base di partenza per l’ottenimento dei neuroni con la mutazione di interesse. Gli studi sui modelli neuronali in 2 dimensioni saranno affiancati alla sperimentazione su modelli cellulari 3D di ultima generazione, gli organoidi cerebrali. Questo sistema rappresenta il modello sperimentale che imita più da vicino lo sviluppo del cervello umano ed è un’opportunità unica per studiare lo sviluppo di questo organo, i disturbi associati e le rispettive terapie. Gli organoidi cerebrali sono già stati utilizzati con successo per lo studio dei meccanismi molecolari associati a diversi disturbi umani, inclusa la Sindrome di Rett. Per attuare il gene editing saranno disegnati e prodotti specifici plasmidi, sequenze di DNA extra-cromosomico in grado di dividersi indipendentemente, che i ricercatori sfruttano per introdurre all’interno delle cellule molecole specifiche, in questo caso i componenti del macchinario di correzione. Il sistema proposto nel progetto MECPer-3D utilizza due plasmidi, una tecnologia in fase di brevettazione da parte dell’Università di Siena. La strategia nasce dalla scelta di utilizzare i virus adenoassociati (Adeno Associated Virus – AAVs) come veicolo dei plasmidi nelle cellule e nel modello animale. Gli AAVs sono dei virus che non possono contenere DNA di dimensioni elevate ma rappresentano un sistema virale più sicuro rispetto ad altri utilizzati per la terapia genica. In particolare, il sierotipo AAV9 può raggiungere il sistema nervoso centrale passando attraverso la barriera emato-encefalica e bersagliare preferenzialmente i neuroni. Tuttavia, l’AAV9 si distribuisce anche ad altri tessuti e questo può ostacolare l’efficiente raggiungimento del cervello oltre a determinare potenzialmente accumulo in altre sedi. Per questo motivo verrà eseguita un’accurata analisi nel modello di topo della sua biodistribuzione, cioè della presenza del virus nei diversi tessuti. Inoltre, verranno sviluppati sierotipi con un tropismo (tendenza a localizzarsi o accumularsi prevalentemente in determinati organi o apparati) più specifico per i neuroni e con la capacità di attraversare la barriera emato-encefalica per ridurre la distribuzione delle particelle virali ai diversi organi e focalizzare la loro azione solo verso il sistema nervoso centrale. Per l’inoculo del virus l’iniezione intravenosa, una tecnica poco invasiva, è stata scelta come via di somministrazione preferenziale. In caso i test mettano in evidenza tossicità o reazioni avverse, verrà presa in considerazione come opzione alternativa, l’iniezione intratecale per mirare efficacemente al sistema nervoso centrale. Sebbene più invasiva, questa via di somministrazione è già stata impiegata nei pazienti e per questo motivo sarà testata nel modello murino qualora la somministrazione endovenosa dovesse risultare inefficace.
I modelli animali, in particolare nel topo, hanno un ruolo fondamentale per lo studio in vivo della genesi della malattia e possono aiutare a comprendere i disturbi umani a livello molecolare e funzionale. Un vantaggio importante per il nostro progetto è che la proteina MeCP2 umana e quella del topo hanno un’omologia del 95% circa. Questa conservazione consente ai topi di essere un modello appropriato per determinare le cause molecolari del disturbo umano e rende quindi questi animali un ottimo modello per lo studio e la ricerca di farmaci e terapie innovative.
In conclusione, grazie alla rete di collaborazione di cui si avvale il progetto MECPer-3D e alla disponibilità di nuove tecnologie, come le tecniche di sequenziamento di ultima generazione, ci aspettiamo che il progetto ci permetta di fare un grande passo avanti verso lo sviluppo di nuove terapie per la Sindrome di Rett.