Una tecnologia innovativa per testare strategie terapeutiche

Un nuovo rivoluzionario procedimento permette di generare neuroni umani che presentano le specifiche mutazioni riscontrate nelle pazienti con SR, consentendo di valutare in tempi più brevi l’efficacia e i possibili effetti tossici di potenziali trattamenti farmacologici.

Alessandra Renieri,
Professore ordinario di Genetica Medica presso l’Università di Siena, Direttore della UOC di Genetica Medica presso l’Azienda Ospedaliera Universitaria Senese

La Sindrome di Rett è caratterizzata da ampia eterogeneità clinica e, oltre alla forma classica, sono state descritte almeno 5 varianti (Hagberg BA, 1994). Queste includono: i) la variante a linguaggio conservato, recentemente denominata variante Zappella, caratterizzata da un decorso clinico più favorevole in cui le bambine recuperano la capacità di esprimesi con frasi brevi e, parzialmente, l’uso delle mani; ii) la variante con convulsioni ad esordio precoce, caratterizzata dalla comparsa di crisi convulsive nei primi 5 mesi di vita; iii) la “forme fruste” in cui i segni clinici caratteristici sono più sfumati; iv) la variante congenita in cui il ritardo psicomotorio è evidente sin dai primi mesi di vita; v) la variante a regressione tardiva, di rarissima osservazione.

Dal 1999, anno in cui è stato identificato il gene MECP2 come causa della forma classica, sono stati fatti numerosi passi avanti anche nella comprensione delle cause genetiche delle varianti Rett (Amir RE, 1999). Nel 2000, abbiamo dimostrato che anche la variante Zappella è causata da mutazioni nel gene MECP2 (De Bona C, 2000). In seguito, abbiamo contribuito all’identificazione di un secondo gene localizzato sempre sul cromosoma X, coinvolto nella variante Rett con convulsioni ad esordio precoce: il gene CDKL5 (Tao J, 2004; Scala E, 2005). Si tratta di un gene che codifica per un fattore nucleare ad attività serina-treonina chinasi la cui espressione durante lo sviluppo cerebrale murino presenta ampie zone di sovrapposizione con il profilo di espressione di MeCP2 (Mari F, 2005). Recentemente il nostro gruppo ha identificato un terzo gene coinvolto della variante congenita della Sindrome di Rett: il gene FOXG1 (Ariani F, 2008). Si tratta di un gene che codifica per una proteina che, come MeCP2, agisce da regolatore trascrizionale, ma che esercita un ruolo fondamentale nelle prime fasi di sviluppo del cervello (Yao J, 2001, Tan K, 2003). Infatti la proteina FoxG1 viene espressa nelle fasi precoci dello sviluppo, cioè durante la vita embrionale, a differenza di quanto avviene per MeCP2 che invece raggiunge la sua massima espressione dopo la nascita e questo potrebbe spiegare l’insorgenza precoce dei sintomi rispetto alla forma classica (Tao W, 1992). Dato che mutazioni in MECP2 e FOXG1 causano un quadro clinico simile, abbiamo iniziato a studiare se le due proteine possano interagire a qualche livello. In collaborazione con il gruppo del Dr. Vania Broccoli, presso l’Istituto Scientifico San Raffaele di Milano, abbiamo quindi studiato in dettaglio la loro espressione nel cervello di topo a livello pre e post-natale. Da questi studi è emerso che, nella corteccia cerebrale, FOXG1 è espresso anche dopo la nascita, seppure a livelli inferiori rispetto alla vita fetale (Ariani F, 2008). Inoltre, a livello di singola cellula, è stato dimostrato che anche la proteina

FoxG1è localizzata nel nucleo ma, a differenza di MeCP2, non sembra essere associata stabilmente alla eterocromatina (Ariani F, 2008). Questi dati, seppur ancora preliminari, sembrano indicare che le vie di segnalazione delle due proteine potrebbero essere in qualche modo interconnesse. è però anche possibile che tale connessione non si verifichi e che le due proteine agiscano come fattori di regolazione a diversi stadi di sviluppo nel processo che porta alla completa formazione della corteccia cerebrale, dalle fasi iniziali fino alla determinazione delle connessioni tra neuroni.

Nonostante l’intenso sforzo scientifico dedicato dai ricercatori di tutto il mondo allo studio dei meccanismi molecolari alla base della Rett, le ovvie limitazioni dovute al fatto che il difetto primario della malattia riguarda il cervello hanno impedito fino ad oggi lo sviluppo di un buon modello sulle cellule che rappresentano i bersagli primari della patologia: i neuroni. Questo ha complicato molto la definizione e lo studio dei processi alterati dal difetto genetico a livello cellulare. Ciò ha inoltre reso più difficile la programmazione di studi in vitro su larga scala tesi a identificare e testare potenziali farmaci.

Un nuovo rivoluzionario procedimento, chiamato riprogrammazione genetica, ha recentemente permesso di ottenere cellule staminali pluripotenti, dette iPS (induced Pluripotent Stem cells) direttamente da fibroblasti umani adulti. Le cellule iPS hanno potenzialità paragonabili alle cellule staminali embrionali primitive e come quest’ultime, possono essere cresciute in vitro per lungo tempo, dare origine ad un numero illimitato di cellule e differenziare in qualsiasi tipo cellulare maturo tra cui neuroni, astrociti, cardiomiociti, fibre muscolari e osteociti (Takahashi K, 2007; Yu J, 2007; Park IH, 2008; Lowry WE, 2008). Le cellule iPS offrono l’importante opportunità di creare un modello innovativo ed unico in vitro delle malattie genetiche (Park IH, 2008; Dimos JT, 2008; Ebert AD, 2008). In particolare per le patologie neurologiche, è possibile ottenere le iPS dal paziente e differenziare quest’ultime in neuroni maturi generando, così, cellule umane “malate”. Questo protocollo permette per la prima volta di generare neuroni umani “malati” in grande quantità ed accessibili per qualsiasi tipo di studio. La derivazione di queste cellule dai pazienti promette di accelerare le scoperte sui meccanismi eziopatologici e sviluppa un modello cellulare umano particolarmente adatto a screening farmacologici per l’identificazione di molecole terapeutiche.

Al fine di creare un modello cellulare che permetta di studiare gli effetti di alterazioni molecolari a carico di MECP2, CDKL5 o FOXG1 direttamente su cellule neuronali umane, proponiamo di utilizzare la tecnologia della riprogrammazione genetica in collaborazione con il gruppo del San Raffaele di Milano. A partire dal 1998, la Genetica Medica di Siena ha raccolto un’ampia casistica di pazienti Rett, sia classiche che varianti, e ha creato una biobanca di campioni di DNA e linee cellulari. Dal 2003, tale risorsa è stata messa a disposizione della comunità scientifica inserendo i dati, resi anonimi tramite l’attribuzione di codici, in un apposito sito web disponibile all’indirizzo www.biobank.unisi.it (Sampieri K, 2007).

Tra le pazienti incluse nella biobanca, 196 presentano una mutazione in MECP2, 9 in CDKL5 e 2 nel gene recentemente identificato FOXG1. Questa biobanca sarà di notevole aiuto poiché permetterà di reclutare velocemente le famiglie disponibili a partecipare allo studio di riprogrammazione e di disporre già di informazioni preziose dal punto vista clinico e molecolare. Questo progetto ci consentirà di partire dai fibroblasti cutanei di pazienti con mutazione in MECP2, CDKL5 e FOXG1 e di controlli sani per ottenere delle cellule immortali che possono essere conservate e indotte a differenziare in neuroni. I fibroblasti potranno essere facilmente ottenuti tramite biopsia cutanea, una procedura medica ben standardizzata che comporta stress e rischi minimi per le pazienti. Il prelievo verrà effettuato infatti con la tecnica standard del Punch-biopsy in anestesia locale a livello della regione dell’avambraccio o della coscia. La riprogrammazione di queste cellule in cellule staminali pluripotenti ci consentirà di avere a disposizione una fonte pressoché illimitata di cellule che verranno indotte a differenziare in neuroni. Sarà in questo modo possibile studiare lo sviluppo e la funzionalità neuronale direttamente su neuroni umani che presentano le specifiche mutazioni riscontrate nelle pazienti. Il confronto delle cellule ottenute da controlli sani con quelle isolate dalle pazienti ci permetterà di valutare se nella Rett siano presenti alterazioni del differenziamento cellulare. Inoltre, queste cellule ci permetteranno di stabilire se siano presenti alterazioni più generali del processo di maturazione dei neuroni. Tramite la tecnologia dei microarray sarà possibile studiare gli effetti delle mutazioni in MECP2, CDKL5, FOXG1 sull’espressione genica. Questa risorsa sarà inoltre fondamentale per lo studio di eventuali approcci terapeutici: la disponibilità di neuroni umani originati da cellule delle pazienti, e quindi con le mutazioni e il background genetico delle pazienti, consentirà di valutare in modo accurato e diretto sia l’efficacia che i possibili effetti tossici di potenziali trattamenti farmacologici. Ciò consentirà l’analisi di un numero molto maggiore di potenziali farmaci in tempi molto più brevi rispetto all’uso di modelli murini permettendo di selezionare un numero limitato di farmaci promettenti da testare su modelli più complessi (modelli murini) e da inserire eventualmente in studi clinici.

Bibliografia

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