Da oltre vent’anni, l’attività di ricerca del laboratorio di Genomica Funzionale ed Epigenetica (Istituto di Genetica e Biofisica A. Buzzati-Traverso, CNR, Napoli), attualmente diretto dalla dott. ssa Floriana Della Ragione, è incentrata sullo studio dei meccanismi genetici ed epigenetici deregolati nella Sindrome di Rett (RTT, OMIM 312750).

La RTT è una patologia infantile rara ed estremamente invalidante che colpisce prevalentemente individui di sesso femminile, i cui sintomi includono disabilità motorie e sociali, caratteristiche autistiche, disabilità intellettiva e problemi respiratori. La RTT è causata principalmente da varianti patogenetiche nel gene X- linked Methyl-CpG-binding Protein 2 (MECP2), che codifica un modulatore epigenetico chiave della trascrizione, cruciale per il corretto funzionamento del cervello. Nonostante i numerosi sforzi effettuati dalla comunità scientifica negli ultimi decenni, ad oggi, il meccanismo patogenetico che sottende la Sindrome di Rett non è del tutto chiaro e non sono ancora disponibili cure efficaci. Alcuni studi pubblicati diversi anni fa hanno messo in evidenza, in cervello di pazienti RTT, alterazioni nei livelli di alcuni glicosfingolipidi (GSL), lipidi glicosilati con un ruolo chiave nel cervello, organo in cui i gangliosidi rappresentano i GSL più abbondanti. Tuttavia, tali dati, generati mediante metodologie a bassa risoluzione, sono ancora preliminari e controversi.

Difetti nel metabolismo dei GSL sono stati correlati a diverse patologie neurologiche, i cui sintomi includono epilessia, atrofia cerebrale e disabilità intellettive. Inoltre, pazienti con mutazioni nel gene ST3GAL5, codificante un enzima chiave per il metabolismo dei GSL, mostrano una sintomatologia simile alla RTT. Su tali basi, è ragionevole ipotizzare che la RTT possa essere caratterizzata da alterazioni del metabolismo dei GSL.
Qualche anno fa, grazie ad una collaborazione con il Prof. G D’Angelo (IBBC-CNR, Napoli ed EPFL, Losanna), abbiamo deciso di caratterizzare a fondo il metabolismo dei GSL in modelli ben noti della Sindrome di Rett, utilizzando metodologie ad altissima risoluzione e di nuova generazione, quali il MALDI-Imaging Mass Spectrometry (MALDI-IMS), che consente di studiare i livelli e la distribuzione di centinaia di metaboliti contemporaneamente in fettine di tessuto come il cervello. Questi studi sono stati effettuati su cervello di topi sintomatici maschi emizigoti Mecp2-/y. In particolare, le fettine di cervello sono state processate per generare spettri di massa, che sono stati, quindi, convertiti in immagini di massa, ciascuna delle quali corrisponde ad un lipide. La ricostruzione di tutte le immagini di massa ha consentito di ottenere delle “mappe lipidomiche” di cervelli di topi Mecp2-/y e topi di controllo (WT), in cui è possibile distinguere le differenti aree del cervello sulla base della sola composizione lipidica.

Un’ispezione dettagliata delle “mappe lipidomiche” ha rivelato che diverse centinaia di sfingolipidi mostrano un’abbondanza differente in cervelli di topi Mecp2-/y rispetto ai topi WT. In particolare, troviamo un minore contenuto di alcuni gangliosidi ed una maggiore abbondanza di precursori di GSL, come la ceramide e di prodotti di vie metaboliche alternative a quella dei gangliosidi. Successivamente, per comprendere se gli alterati livelli degli sfingolipidi osservati nei cervelli dei topi Mecp2-/y potessero dipendere da un’alterata regolazione dell’espressione di geni codificanti fattori coinvolti nel metabolismo dei GSL (glico-geni), abbiamo comparato l’espressione genica globale in ippocampo (regione del cervello funzionalmente implicata nella RTT) di topi maschi Mecp2-/y e topi WT. Tale esperimento ha evidenziato in topi mutanti un’alterata espressione di numerosi geni, molti dei quali codificano i glico-geni. Abbiamo, inoltre, riscontrato un’espressione aumentata del gene Auts2, mutato in disordini dello spettro autistico e codificante una proteina coinvolta nel metabolismo dei GSL, e del gene Cert1, che codifica il trasportatore della ceramide. Abbiamo anche dimostrato che la proteina MeCP2, in condizioni fisiologiche, si lega sulla regione di regolazione dell’espressione di tali geni. Nel loro insieme, tali dati suggeriscono che MeCP2 possa regolare il metabolismo dei GSL attraverso la regolazione diretta dell’espressione dei glico-geni.
Esperimenti attualmente in corso indicano che il metabolismo dei GSL è alterato anche nel cervello di topi femmine eterozigoti Mecp2+/- che, sebbene mostrino una sintomatologia più lieve dei topi maschi, sono geneticamente più simili alle pazienti RTT.

Abbiamo, successivamente, messo in luce uno sbilanciamento del metabolismo dei GSL anche in neuroni ottenuti dal differenziamento di cellule staminali embrionali di topo, portatrici di due delle mutazioni più frequenti nella Sindrome di Rett, T158M e R306C, evidenziando alterazioni nei livelli di alcuni gangliosidi e nell’espressione di numerosi glicogeni, sebbene a differenti livelli nelle due linee cellulari mutanti.
Infine, grazie ad una fruttuosa collaborazione con la dott. Silvia Russo (Istituto Auxologico di Milano), stiamo caratterizzando le disfunzioni del metabolismo dei GSL in un sistema cellulare ancora più vicino alle pazienti, rappresentato dai neuroni ottenuti dal differenziamento di cellule staminali pluripotenti indotte (iPSC) ottenute, a loro volta, dalla riprogrammazione di cellule del sangue periferico di due pazienti femmine portatrici delle mutazioni R255X e R133C, e di un paziente maschio portatore della mutazione G252Rfs7ter. I primi risultati ottenuti indicano un’alterata espressione di numerosi glico-geni ed una maggiore espressione di CERT1 e AUTS2, anche se tali alterazioni variano a seconda del tipo di mutazione. Attualmente stiamo ottimizzando le condizioni per analizzare il contenuto dei gangliosidi in tali cellule.
In sintesi, gli studi condotti finora indicano che i livelli di numerosi GSL e l’espressione di numerosi glico-geni sono alterati in cervello di topi modello della Sindrome di Rett. I nostri dati, suggeriscono, inoltre che MeCP2 possa regolare in modo diretto l’espressione dei glico-geni. Abbiamo, inoltre, dimostrato che mutazioni comuni nelle pazienti RTT causano uno sbilanciamento del metabolismo dei GSL sia in un contesto neuronale murino che umano. Le disfunzioni della proteina MeCP2 sembrano, quindi, essere responsabili delle alterazioni del metabolismo dei GSL attraverso un’alterata espressione dei glico-geni e questo potrebbe ragionevolmente contribuire alla patogenesi della RTT. Sulla base di tale ipotesi, pensiamo che lo sbilanciamento del metabolismo dei GSL possa rappresentare un nuovo bersaglio per lo sviluppo di strategie terapeutiche per la Sindrome di Rett. Abbiamo, quindi, deciso di sviluppare dei trattamenti farmacologici con analoghi della sfingosina, che rappresenta un componente strutturale degli sfingolipidi.

A tale scopo, abbiamo focalizzato l’attenzione su Fingolimod, Ozanimod e Siponimod, tre farmaci già approvati dalla FDA e dall’EMA per il trattamento della sclerosi multipla, e questo rende il nostro approccio un riposizionamento del farmaco. Il Fingolimod è un analogo della sfingosina di prima generazione che mitiga i difetti cognitivi in altre patologie, promuove la sintesi dei gangliosidi in topi modello della corea di Huntington, ed attenua il fenotipo RTT-like in topi; tuttavia non è ancora noto se i suoi effetti benefici siano mediati dalla modulazione del metabolismo dei GSL. L’Ozanimod ed il Siponimod sono analoghi della sfingosina di nuova generazione, che potrebbero agire attraverso differenti meccanismi. Tuttavia, non è nota la loro capacità di modulare il metabolismo dei GSL ed il loro effetto sul fenotipo RTT-like non è mai stato studiato. Inoltre, questi ultimi due farmaci presentano una maggiore selettività per i recettori della sfingosina. I primi trattamenti da noi effettuati con il Fingolimod in topi maschi pre-sintomatici Mecp2-/y, hanno mostrato che il farmaco prolunga significativamente la durata della vita, riduce la sintomatologia RTT e preserva gli animali dalla perdita di peso corporeo. Attualmente stiamo valutando l’effetto benefico del farmaco sulla correzione dei difetti del metabolismo dei GSL.

Prossimamente, effettueremo i trattamenti con Fingolimod, Ozanimod e Siponimod anche sui topi femmine eterozigoti Mecp2+/-, ed analizzeremo la capacità dei farmaci di recuperare il fenotipo RTT-like e correggere i difetti del metabolismo dei GSL. Caratterizzeremo, inoltre, a fondo i difetti del metabolismo dei GSL in neuroni derivati da iPSC ottenute da pazienti RTT e testeremo su tali cellule la capacità degli analoghi della sfingosina di correggere i difetti del metabolismo dei GSL e recuperare le alterazioni morfologiche. Ci prefiggiamo, inoltre, di studiare il metabolismo dei GSL anche in topi Mecp2-/y pre-sintomatici, al fine di identificare eventuali bio-marcatori precoci della malattia e comprendere se le alterazioni del metabolismo dei GSL sono una causa o un effetto dell’inasprimento del fenotipo pato-logico. I risultati che otterremo, speriamo, potranno offrire nuove prospettive per l’ottimizzazione di nuovi protocolli terapeutici per le pazienti RTT.