Relazione del lavoro svolto dalla genetica medica di Siena sullo studio delle differenze genetiche tra le due varianti, lavoro svolto con il finanziamento di una borsa di studio alla dottoressa Mencarelli

Maria Antonietta Mencarelli e Alessandra Renieri – Genetica Medica, Policlinico Santa Maria alle Scotte, Siena

La sindrome di Rett è caratterizzata da un’ampia variabilità clinica. Diversi meccanismi sono stati ipotizzati alla base di tale variabilità. Uno dei fattori maggiormente indagati è l’inattivazione del cromosoma X, ovvero il fenomeno biologico per cui solo uno a caso dei due cromosomi X, o quello “sano” o quello con la mutazione, risulta essere attivo in ciascuna cellula, mentre l’altro viene “spento”. Nei casi in cui la percentuale di inattivazione è sbilanciata a favore dell’uno o dell’altro, il quadro clinico può apparire più o meno grave. Tuttavia altri elementi devono essere presi in esame come cofattori nella modulazione del fenotipo. I dati di letteratura hanno inoltre messo in rilievo come il tipo di mutazione del gene MECP2 non può essere sufficiente a spiegare tale variabilità; la stessa mutazione del gene MECP2 può infatti essere identificata in una vasta gamma di fenotipi dalla forma classica (RTT) alla variante Zappella (Z-RTT) (Zappella 1992; Scala et al. 2007; Renieri et al. 2009). È nella nostra esperienza l’identificazione della stessa mutazione in MECP2 in coppie di sorelle con fenotipo discordante, in particolare una RTT e l’altra con Z-RTT (http://www.biobank.unisi.it) (Sampieri et al., 2008).

Abbiamo ipotizzato che differenze nei livelli di attività di geni che interagiscono o che sono target di MeCP2 possano modulare gli effetti delle mutazioni in MECP2. Tali differenze possono essere ricondotte alla presenza di CNV (variazioni nel numero di copie) genomiche. È recente il concetto che variazioni del numero di copie di un segmento genico (delezioni, duplicazioni o amplificazioni) possa influenzare il quadro clinico, non determinando una condizione di malattia di per sé, ma conferendo protezione o suscettibilità ad una data condizione.

Abbiamo confrontato i DNA di due coppie di sorelle con stessa mutazione in MECP2 e fenotipo discordante al fine di identificare differenze nella presenza di CNV. A tale proposito è stata impiegata tecnica di array-CGH, che permette di rilevare delezioni o duplicazioni cromosomiche anche di piccole dimensioni nell’intero corredo genomico. Tutte le variazioni identificate risultano essere già riportate come polimorfismi (http://projects.tcag.ca/bioxrt/). In particolare, l’analisi condotta sulla prima coppia di sorelle ha permesso di individuare 9 riarrangiamenti diversi, tra cui una duplicazione del braccio corto del cromosoma 16, che risulta presente nella sorella RTT classica e nel padre, mentre è assente nella sorella Z-RTT e nella madre. In questa regione, mediante l’utilizzo dei ChIP-chip (chromatin immunoprecipitation promoter array), analisi di recente introduzione che permette di prevedere i possibili geni bersaglio di MeCP2, sono stati identificati due potenziali geni target di MeCP2: NFATC2IP e SPIN1 (Prof. JM LaSalle, Medical Microbiology and Immunology, University of California). In particolare, NFATC2IP appartiene alla via del segnale calcineurin/NFAT coinvolta nella patogenesi della sindrome di Down ed è essenziale per la crescita assonale in risposta delle neutrofine (Graef et al., 2003). Analisi di PCR quantitativa condotta sull’RNA hanno dimostrato un significativo aumento del livello di espressione del gene NFATC2IP nella sorella affetta dalla forma classica e nel padre portatore della stessa duplicazione nel cromosoma 16. Di contro la sorella Z-RTT esprime due copie normali dello stesso gene. Questi risultati dimostrano che la CNV ha un effetto sul livello di espressione del gene NFATC2IP. Lo stesso tipo di esperimento ha evidenziato una riduzione del livello di espressione di un altro gene, SPIN1, nella ragazza Z-RTT dimostrando che effettivamente SPIN1 è regolato da MECP2. La sorella RTT classica invece presenta un normale livello di espressione del gene come anche suo padre. Questo dato dimostra che la duplicazione ha un effetto funzionale quando combinato con la mutazione MECP2 suggerendo SPIN1 come un buon candidato nel ruolo di gene modificatore nella RTT. Nella ragazza Z-RTT è stata identificata inoltre una duplicazione sul cromosoma 1 che include il gene CROCC. L’analisi di espressione su mRNA ha evidenziato che i livelli di CROCC sono raddoppiati nella sorella RTT rispetto ai controlli, mentre nella sorella Z-RTT risultano amplificati fino a 28 volte. Tale risultato ci indirizza verso l’ipotesi che MECP2 possa avere un ruolo come repressore di CROCC. Un’altra CNV interessante è stata identificata nel cromosoma 1 e include il gene ENAH, un componente fondamentale per lo sviluppo della corteccia cerebrale e per la corretta localizzazione dei neuroni nella corteccia stessa (Goh et al., 2002).

L’analisi condotta sull’altra coppia di sorelle ha portato all’identificazione di 7 riarrangiamenti, di cui in uno comune con l’altra coppia. Si tratta di una duplicazione del cromosoma 8 presente in entrambi i casi nelle sorelle con fenotipo RTT classica. Tale duplicazione include il gene ADAM5, che rappresenta un buon gene candidato in quanto appartiene ad una famiglia di proteine coinvolte nello sviluppo del sistema nervoso dove regolano tra l’altro la crescita assonale e la mielinizzazione (Wolfsberg et al., 1995; Yang et al., 2006).

I risultati fino ad ora raggiunti sono indubbiamente incoraggianti e rappresentano una buona base nell’ambizioso progetto di chiarificazione del complesso meccanismo alla base della Sindrome di Rett e della sua ampia variabilità, nell’auspicio che la comprensione dei meccanismi che modulano il fenotipo possa aprire la strada a nuove strategie terapeutiche.

BIBLIOGRAFIA

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• Zappella M (1992). The Rett girls with preserved speech. Brain Dev 14:98-101.