Ilaria Meloni, Alessandra Renieri
Genetica Medica, Dipartimento di Biotecnologie Mediche, Università degli Studi di Siena
Negli anni passati il gruppo della Genetica Medica di Siena, coordinato dalla prof.ssa Alessandra Renieri, ha generato cellule staminali pluripotenti indotte (induced Pluripotent Stem Cells = iPSCs) da pazienti con mutazione nei geni MECP2 e FOXG1, al fine di utilizzarle come innovativo modello cellulare per lo studio dei meccanismi alla base della sindrome di Rett (RTT) classica (mutazioni in MECP2) e delle sue varianti (mutazioni in FOXG1). Le cellule iPSCs si ottengono a partire da Fibroblasti, cellule presenti nella cute che possono essere isolate tramite biopsia cutanea, una procedura medica minimamente invasiva; una volta ottenute, le iPSCs possono essere indirizzate con opportuni protocolli a differenziare in tipi cellulari specifici, incluse le cellule del cervello, i neuroni; queste cellule possono essere utilizzate come modello paziente-specifico per studiare come le mutazioni alterano lo sviluppo e la funzionalità dei neuroni.
Sia MECP2 che FOXG1 codificano per regolatori trascrizionali, cioè proteine la cui funzione all’interno della cellula è quella di controllori, che decidono quanto e quando altri geni debbano essere espressi. Per tale motivo, al fine di caratterizzare i meccanismi della malattia e identificare possibili bersagli terapeutici, abbiamo deciso di confrontare il profilo globale di espressione genica di neuroni mutati in MECP2 o in FOXG1 con quello di neuroni di controllo tramite RNA-seq, un tecnologia di sequenziamento di ultima generazione che consente di analizzare contemporaneamente l’espressione di tutti i geni contenuti nel genoma umano. L’analisi è stata effettuata su neuroni differenziati da iPSCs derivate da 2 pazienti con diverse mutazioni in MECP2, scelte tra quelle più frequentemente riscontrate nelle pazienti, e due pazienti con diverse mutazioni nel gene FOXG1.
L’analisi dei neuroni mutati in MECP2 ha evidenziato, rispetto ai controlli, una variazione nei livelli di espressione di circa 900 geni. Al fine di identificare processi biologici potenzialmente rilevanti per l’insorgenza della RTT, questi geni sono stati sottoposti ad una analisi bioinformatica che ha permesso di raggrupparli in base al coinvolgimento in processi biologici comuni. Tale analisi ha evidenziato, tra gli altri, una alterazione di geni collegati alla regolazione del network dei microtubuli. I microtubuli sono lunghe catene costituite da due componenti di base, la Tubulina-a e la Tubulina-b, e rappresentano una delle componenti principali del citoscheletro, lo “scheletro” della cellula. In particolare, le nostre analisi ci hanno permesso di identificare una eccessiva espressione di un gene, HDAC6, che rimuove dalla Tubulina-a uno specifico gruppo detto Acetile; il rapporto tra Tubulina-a con (acetilata) e senza gruppo Acetile (deacetilata) è importante per la regolazione di molti processi connessi con la maturazione e la funzionalità dei neuroni, alcuni dei quali risultano alterati in modelli sia animali che cellulari di sindrome di Rett. In linea con l’eccessiva espressione di HDAC6, i neuroni delle pazienti presentano una riduzione della quantità di Tubulina-a acetilata. HDAC6 appartiene alla famiglia proteica delle Istone Deacetilasi (HDAC), proteine molto studiate dal punto di vista farmacologico per il loro coinvolgimento nel cancro. Sono state sviluppate negli ultimi anni diverse molecole in grado di ridurre l’attività di uno o più membri della famiglia delle HDAC. Al fine di ridurre il rischio di effetti collaterali dovuti all’azione su HDAC diverse da HDAC6, abbiamo concentrato la nostra attenzione su quelle molecole che agissero in modo selettivo su HDAC6. In particolare, abbiamo testato due inibitori altamente selettivi, per uno dei quali sono attualmente in corso trial clinici su pazienti oncologici. Entrambi i composti hanno dimostrato la capacità di incrementare i livelli di Tubulina-a acetilata; qualora l’effetto sia confermato su ulteriori pazienti, tali farmaci potrebbero quindi rappresentare un potenziale approccio terapeutico per la RTT.
Potenzialmente rilevante dal punto di vista terapeutico è anche l’eccessiva espressione osservata nelle cellule mutate in MECP2 di 2 geni (CACNA2D2 e CANCA2D3) che codificano per componenti dei canali del Calcio. I canali del Calcio sono attivati in seguito all’attività delle sinapsi e contribuiscono a modularla; in particolare, i due geni la cui espressione risulta alterata sono importanti per regolare l’apertura e la chiusura del canale, in risposta a vari neurotrasmettitori. Ciò che rende questi due geni particolarmente interessanti in un’ottica terapeutica è il fatto che essi rappresentano il sito di legame del Pregabalin, un farmaco comunemente utilizzato per il trattamento degli stati di ansia e che agisce modulando proprio l’attività dei canali del Calcio. Ulteriori studi saranno necessari al fine di validare la rilevanza dell’alterazione di CACNA2D2 e CANCA2D3 (e potenzialmente di altre subunità di canali del Calcio) nella RTT; se tale rilevanza sarà confermata, il Pregabalin potrebbe rappresentare una possibile opzione terapeutica di rapida applicazione.
L’analisi bioinformatica dei geni con espressione alterata emersi dall’RNA-seq per i neuroni mutati in FOXG1 è attualmente in corso; da una prima valutazione emerge, tra i geni espressi in eccesso nei neuroni mutati, un arricchimento per geni coinvolti nel circuito del GABA. Il GABA è il principale neurotrasmettitore inibitorio, che regola in senso negativo l’attività neuronale. Una eccessiva espressione di geni coinvolti in questo circuito era già stata evidenziata da noi in passato sia nel modello animale (topo con una sola copia funzionante del gene FOXG1) che in neuroni derivati da iPSCs ottenute da una paziente con delezione completa di una copia di FOXG1 (Patriarchi T et al, Eur J Hum Genet 2016), confermando la rilevanza di questo circuito per la patogenesi della RTT dovuta a mutazioni in FOXG1. Dal punto di vista terapeutico, esistono in commercio diversi farmaci che modulano in senso negativo l’attività dei neuroni GABAergici e che potrebbero essere quindi valutati per una possibile applicazione terapeutica.
Negli ultimi anni ha guadagnato notevole rilevanza la tecnologia CRISPR/CAS9 che consente di manipolare in modo estremamente preciso il genoma di qualunque cellula eucariotica. Questa tecnologia deriva da una forma di sistema immunitario dei batteri, che consente loro di resistere alle infezioni virali, e si basa su due componenti principali: la CAS9, una proteina che agisce come una forbice tagliando il DNA, e dei corti frammenti di DNA, detti “guide”, che indirizzano la CAS9 verso specifici siti di taglio. Scegliendo le guide in modo opportuno e aggiungendo una ulteriore componente, il DNA stampo, è possibile utilizzare questa tecnologia per tagliare il DNA in corrispondenza di una specifica mutazione puntiforme e sostituire la sequenza mutata con quella normale, correggendo così il difetto. Studi recenti hanno dimostrato l’efficacia di questa tecnologia per la correzione del difetto genetico in cellule di pazienti affetti da X-Fragile, la più comune forma di disabilità intellettiva legata al cromosoma X. Il nostro laboratorio, con il supporto delle famiglie FOXG1 che hanno effettuato una efficace campagna di fund-raising, sta quindi iniziando un progetto di ricerca che mira a testare l’efficienza e la sicurezza del sistema CRISP-R/CAS9 per la sostituzione della copia mutata del gene FOXG1 con la corrispondente sequenza normale. Scopo finale è dimostrare in un modello cellulare ex-vivo l’applicabilità del sistema CRISPR/CAS9 per un approccio di terapia genica. Gli esperimenti verranno effettuati in cellule iPSCs derivate da pazienti con diverse mutazioni puntiformi nel gene FOXG1; per permettere al CRISPR/CAS9 di entrare all’interno della cellula verrà utilizzato un sistema virale (AAV = Adeno-Associated Virus).
